Siapa bilang melawan kanker itu harus seperti adegan di film action yang penuh ledakan? Ternyata, ada cara yang lebih smart dan less invasive untuk menaklukkan sel-sel nakal itu. Bayangkan saja, kita bisa memanfaatkan cahaya untuk mengaktifkan agen khusus yang akan menghancurkan kanker dari dalam. Kedengarannya seperti fiksi ilmiah, kan? Tapi, inilah yang sedang dikembangkan oleh para ilmuwan!
Kanker sel skuamosa oral (OSCC), atau gampangnya kanker mulut, adalah masalah kesehatan global yang cukup serius. Setiap tahun, ada ratusan ribu kasus baru yang terdiagnosis, dan sayangnya, tingkat kematiannya juga tinggi. Operasi konvensional, meski efektif menghilangkan lesi primer, seringkali meninggalkan efek samping yang tidak mengenakkan, seperti gangguan fungsi wajah dan perubahan estetika. Selain itu, sel kanker punya kemampuan DNA-damage repair yang lebih tinggi dari sel normal, bikin mereka jadi resisten terhadap radioterapi dan kemoterapi. Jadi, challenge accepted bagi para peneliti untuk mencari solusi yang lebih canggih.
Nah, di sinilah terapi fotodinamik (PDT) hadir sebagai game changer. PDT punya beberapa keunggulan, seperti selektivitas yang dikontrol cahaya, minimal invasif, dan efek samping yang lebih rendah. Beberapa photosensitizer yang sudah disetujui FDA, seperti chlorin e6 (Ce6) dan asam 5-aminolevulinat, sudah digunakan untuk mengobati tumor superfisial. Tapi, hampir semua kanker solid itu hipoksia (kekurangan oksigen), dan kondisi ini bisa mengurangi efektivitas agen-agen tersebut. Ibaratnya, mau bikin api tapi nggak ada oksigen, susah kan?
Ada juga photosensitizer lain, seperti MnO2 dan Fe-MOF, yang bisa mengkatalisis produksi •OH (radikal hidroksil) yang sangat beracun dengan H2O2, dan menyebabkan kerusakan multiorganel pada tumor. Meski bisa dimodifikasi untuk menghasilkan •OH yang lebih targeted, pelepasan ion logam berpotensi membahayakan kesehatan. Jadi, masih perlu upgrade lagi!
Dalam pencarian berkelanjutan untuk fotokatalis antikanker yang bisa menyebabkan kerusakan tumor yang tidak bergantung pada oksigen, menghambat DNA-damage repair, dan mencegah kerusakan organ akibat residu logam, para peneliti kini mengarahkan pandangan mereka pada polymeric carbon nitride (PCN). PCN adalah nanomaterial yang hanya terdiri dari unsur karbon dan nitrogen. Sayangnya, efek antikanker PDT dari PCN murni belum memuaskan karena terbatasnya •OH yang dihasilkan akibat permukaan yang inert dan rekombinasi carrier yang parah.
Tantangan ini dijawab dengan memodifikasi PCN. Dalam penelitian ini, nitrogen vacancy–modified PCN (NV-PCN) disintesis untuk meningkatkan aksesibilitas sel dari carbon nitride dengan meningkatkan kandungan –NH2 dan menyediakan lebih banyak situs reaktif untuk reduksi H2O2. Hasilnya? NV-PCN memicu ledakan sinkron •OH di sekitar nukleus dan mitokondria sel Cal-27 (sel kanker mulut) di bawah penyinaran. Ini menyebabkan kerusakan DNA nukleus (peningkatan ekspresi double-strand break marker γH2AX) dan disfungsi mitokondria (penurunan mitochondrial membrane potential [MMP]). Disfungsi mitokondria memicu badai ROS untuk mengintensifkan kerusakan DNA, dan rantai energi ATP melemah untuk menghambat DNA-damage repair (pengurangan ekspresi 53BP1 dan GADD45A). Dibandingkan dengan Ce6, NV-PCN menunjukkan kinerja antikanker yang sangat baik in vitro dan in vivo, membuka jalan baru untuk PDT kanker berbasis carbon nitride.
NV-PCN: Pahlawan Baru dalam Terapi Kanker?
Morfologi PCN murni dan NV-PCN diamati dengan TEM. NV-PCN menunjukkan struktur serpihan tidak teratur dengan diameter sekitar 100 nm, setengah dari PCN. Uji XRD dan FTIR dilakukan untuk mengungkap fase kristal dan gugus fungsi permukaan. Hasilnya, NV-PCN memiliki struktur kristal yang mirip dengan PCN, tetapi semua puncaknya melemah, menunjukkan struktur yang terdistorsi dan dimensi sel unit yang lebih kecil. Spektra FTIR menunjukkan bahwa struktur dasar carbon nitride tetap terjaga selama proses pemanggangan sekunder.
XPS digunakan untuk mendeteksi jenis dan posisi vacancies yang terbentuk dalam proses pemanggangan sekunder. NV-PCN memiliki rasio C/N yang lebih tinggi daripada PCN, membuktikan bahwa nitrogen vacancies (NV) diperkenalkan dalam carbon nitride setelah pemanggangan sekunder. Puncak karakteristik N–C=N dari NV-PCN bergeser ke energi pengikatan yang lebih rendah dibandingkan dengan PCN, yang disebabkan oleh pengayaan elektron negatif di sekitar NV. Analisis kandungan berbagai spesies N menunjukkan bahwa defek N3C diperkenalkan dalam NV-PCN. Berdasarkan hasil ini, struktur katalis NV-PCN dapat disimpulkan.
Karena NV-PCN digunakan sebagai agen PDT untuk terapi kanker, sifat optik dan struktur pita energinya diperiksa dengan spektra UV-vis diffuse reflectance, plot Tauc, dan plot Mott–Schottky. NV-PCN menunjukkan bandgap (Eg) yang lebih besar daripada PCN, yang disebabkan oleh efek kurungan kuantum yang diinduksi oleh nanosheet NV-PCN yang lebih kecil. Kapasitas penyerapan cahaya tampak NV-PCN yang sedikit lebih kuat mungkin disebabkan oleh keadaan midgap yang diperkenalkan oleh NV. Plot Mott–Schottky menunjukkan karakteristik semikonduktor tipe-n yang khas dari PCN dan NV-PCN. Hasilnya, PCN dan NV-PCN memiliki struktur pita energi yang sesuai untuk mengkatalisis reaksi H2O2/•OH + OH−.
Pengukuran spektroskopi DRIFT in situ dilakukan untuk mengungkap mekanisme generasi •OH fotokatalitik pada PCN dan NV-PCN. Intensitas puncak meningkat secara signifikan setelah memperkenalkan NV, menunjukkan bahwa NV memfasilitasi adsorpsi H2O2 pada carbon nitride. Seiring dengan bertambahnya waktu iradiasi cahaya, semua puncak menjadi lebih lemah dan puncak vibrasi peregangan HO–OH bergerak ke arah gelombang tinggi, yang disebabkan oleh reduksi H2O2 oleh fotoelektron pada NV-PCN menjadi •OH dan OH−. Oleh karena itu, dispekulasikan bahwa H2O2 teradsorpsi pada situs N dari cincin heptazin yang melekat pada NV pada NV-PCN.
Untuk mengevaluasi kemampuan PCN dan NV-PCN menghasilkan •OH, spektrum EPR in situ diperiksa. Sinyal radikal •OH karakteristik diamati, menunjukkan bahwa baik katalis PCN maupun NV-PCN dapat mereduksi H2O2 menjadi •OH. Intensitas sinyal keseluruhan pada NV-PCN jauh lebih menonjol daripada PCN, menunjukkan kemampuan NV-PCN yang lebih kuat untuk menghasilkan •OH daripada PCN, yang disebabkan oleh lebih banyak situs aktif untuk reduksi H2O2 pada NV-PCN.
Ledakan •OH: Senjata Rahasia NV-PCN Melawan Kanker
PDT adalah pendekatan inovatif dalam pengobatan kanker, menawarkan keunggulan yang berbeda dari metode terapeutik konvensional, seperti toksisitas rendah, presisi, kontrol spatiotemporal, dan minimal invasif. Untuk menghindari resistensi terhadap PDT yang bergantung pada O2 pada tumor hipoksia, NV-PCN dirancang sebagai photosensitizer tipe I yang tidak bergantung pada O2. Penelitian ini bertujuan untuk memanfaatkan NV-PCN untuk mengubah H2O2 yang diekspresikan berlebihan di dalam tumor menjadi •OH yang sangat beracun, sehingga menghancurkan sel kanker.
Untuk memvalidasi lebih lanjut ekspresi •OH tumoral yang dipromosikan NV-PCN oleh PDT, sel Cal-27 dikokulturasikan dengan NV-PCN dan kadar •OH intraseluler ditentukan menggunakan •OH probe, yang dapat bereaksi dengan •OH yang dihasilkan dari reduksi H2O2 untuk memancarkan fluoresensi hijau. Rasio sel penghasil •OH meningkat secara signifikan pada kelompok NV-PCN + cahaya, menunjukkan bahwa lebih banyak •OH dihasilkan. Kelompok NV-PCN + cahaya menunjukkan intensitas fluoresensi hijau yang lebih kuat, menunjukkan bahwa NV-PCN memiliki aktivitas fotokatalitik yang serupa dalam aplikasi biologis. Dengan demikian, NV-PCN, sebuah fotokatalis cahaya baru, dapat bertindak sebagai agen mirip Fenton untuk menambah ekspresi •OH intraseluler yang efisien dan menginduksi apoptosis sel, sehingga mencapai PDT.
NV-PCN: Bukan Sekadar Ramah, Tapi Juga Mematikan Bagi Sel Kanker
Sebelum menilai efek terapeutik NV-PCN pada iluminasi cahaya LED putih, penting untuk menggunakan uji CCK-8 standar untuk mengevaluasi efek sitotoksik, yang merupakan masalah yang sangat penting dalam aplikasi medis nanomaterial. Setelah inkubasi dengan PCN dan NV-PCN selama 24 jam, tidak ada sitotoksisitas yang jelas diamati pada sel Cal-27, bahkan pada konsentrasi hingga 1 mg·mL−1, menunjukkan sitotoksisitas PCN dan NV-PCN yang dapat diabaikan. Sebaliknya, ketika terpapar cahaya LED putih, viabilitas sel secara bertahap menurun dengan meningkatnya konsentrasi NV-PCN, dan viabilitas sel kelompok yang diinkubasi dengan 2 mg·mL−1 NV-PCN adalah yang terendah di antara semua kelompok.
Namun, bahkan dalam kondisi tidak teriradiasi, 2 mg·mL−1 NV-PCN masih memengaruhi viabilitas sel. Oleh karena itu, 1 mg·mL−1 dipilih sebagai konsentrasi optimal untuk eksperimen sel selanjutnya. Ketika menambahkan isopropanol (scavenger dari •OH) ke dalam sistem (kelompok NV-PCN + cahaya), viabilitas sel meningkat secara signifikan, yang menunjukkan bahwa •OH memainkan peran kunci dalam inaktivasi fotokatalitik sel kanker NV-PCN. Selain itu, area fluoresensi merah yang lebih besar pada gambar sel hidup dan mati untuk kelompok NV-PCN + cahaya menguatkan hasil uji CCK-8. Hasilnya menunjukkan bahwa NV-PCN tidak hanya memiliki biokompatibilitas yang besar, tetapi juga menunjukkan kemampuan membunuh sel kanker fotodinamik yang lebih efisien daripada PCN di bawah iluminasi. Oleh karena itu, penelitian ini menyelidiki secara mendalam sifat biologis NV-PCN.
Selanjutnya, penilaian kapasitas internalisasi NV-PCN yang cukup dalam sel kanker dilakukan, karena ini sangat penting untuk efek terapeutik lebih lanjut. Mikroskopi hamburan medan gelap digunakan untuk memvisualisasikan distribusi intraseluler NV-PCN. Ada peningkatan sinyal yang jelas pada kelompok NV-PCN dibandingkan dengan kelompok kontrol, menunjukkan penyerapan NV-PCN yang efisien oleh sel Cal-27. Fluoresensi hijau yang berasal dari NV-PCN terutama terkonsentrasi di sitoplasma dan nukleus dan mengintensifkan dengan waktu inkubasi yang lebih lama, menunjukkan bahwa penyerapan seluler efektif NV-PCN bergantung pada durasi inkubasi.
NV-PCN, sebuah photosensitizer yang kuat, mengubah H2O2 intraseluler menjadi •OH di bawah iradiasi cahaya LED putih. Di antara ROS, •OH memberikan kerusakan yang lebih besar pada sel kanker karena efeknya yang lebih agresif pada nuklei, menginduksi DNA double-strand breaks. Di sini, DNA double-strand breaks dievaluasi dengan pewarnaan γH2AX menggunakan pelabelan imunofluoresensi dan Western blot. Hasilnya menunjukkan bahwa kepadatan γH2AX terjadi lebih tinggi pada kelompok NV-PCN + cahaya dan Ce6 + cahaya daripada pada kelompok kontrol, cahaya, dan NV-PCN saja, menunjukkan bahwa NV-PCN dan Ce6 dapat sangat meningkatkan kerusakan DNA yang diinduksi cahaya. Namun, telah diamati bahwa terjadinya kerusakan DNA pada sel kanker mempromosikan inisiasi mekanisme DNA damage–repair, yang menghasilkan resistensi tumor.
•OH berpotensi menginduksi kerusakan mitokondria karena reaktivitas •OH yang superior. Mengingat hal ini, fungsi mitokondria dari kelompok yang berbeda dievaluasi dengan menganalisis MMP sel. Ketika dibandingkan dengan kelompok perlakuan tunggal (kontrol, NV-PCN, dan cahaya), sel Cal-27 yang diobati dengan Ce6 dan NV-PCN yang diiradiasi dengan cahaya mengubah lebih banyak polimer JC-1 menjadi monomer JC-1 pada mitokondria, menunjukkan penurunan MMP pada sel Cal-27, terutama pada kelompok NV-PCN + cahaya, mengungkapkan bahwa lebih banyak •OH yang dihasilkan oleh NV-PCN selama acara PDT mengakibatkan disfungsi mitokondria. Mitokondria mengatur ROS dan menjaga keseimbangan redoks seluler. Disfungsi pada mitokondria meningkatkan ROS, memperburuk kerusakan DNA dan mungkin menyebabkan disfungsi seluler dan perkembangan penyakit.
Untuk memverifikasi lebih lanjut generasi ROS intraseluler total NV-PCN di bawah iluminasi LED, DCFH-DA digunakan sebagai fluorescent probe untuk memantau produksi intraseluler ROS. DCFH-DA dihidrolisis oleh esterase setelah memasuki sel untuk membentuk DCFH, yang dapat bereaksi dengan ROS dalam sel dan menunjukkan fluoresensi hijau. Intensitas fluoresensi hijau yang kuat diamati pada kelompok NV-PCN + cahaya. Sebaliknya, fluoresensi yang dapat diabaikan diamati pada kelompok kontrol, NV-PCN, dan cahaya. Tingkat generasi ROS intraseluler total pada sel Cal-27 juga dideteksi secara kuantitatif menggunakan flow cytometry, dan hasil serupa diperoleh dengan yang disebutkan di atas.
Dalam sel eukariotik, mitokondria sangat penting untuk mengatur energi intraseluler. Setelah kerusakan mitokondria, kandungan ATP intraseluler menurun. Dibandingkan dengan kelompok perlakuan tunggal, kandungan ATP kelompok NV-PCN + cahaya berkurang secara signifikan, yang mengarah pada penurunan regulasi perbaikan kerusakan DNA. 53BP1 dan GADD45A, faktor kunci dalam proses DNA damage–repair, dievaluasi lebih lanjut. Perlakuan NV-PCN + cahaya secara nyata menurunkan ekspresi protein 53BP1 dan GADD45A. Selain itu, penurunan regulasi 53BP1 dan GADD45A dikonfirmasi lebih lanjut oleh analisis Western blot, dan sel kanker yang diobati dengan NV-PCN + cahaya menunjukkan perbaikan kerusakan DNA yang gagal.
Membasmi Sel Kanker Hingga Akarnya: Efek Antikanker NV-PCN In Vitro
Evaluasi efek terapeutik pada iradiasi cahaya dievaluasi oleh uji EDU. Ada proliferasi sel Cal-27 sebesar 80%, 76%, dan 60% setelah perlakuan dengan NV-PCN saja, cahaya saja, dan Ce6 + cahaya, masing-masing, sementara hanya 26% yang bertahan hidup di bawah perlakuan NV-PCN + cahaya. Demikian pula, uji Transwell mengungkapkan migrasi sel yang lebih sedikit pada kelompok NV-PCN + cahaya daripada pada tiga kelompok lainnya. Hasil ini, bersama dengan temuan sebelumnya, menimbulkan kemungkinan bahwa dibandingkan dengan Ce6, NV-PCN akan menginduksi efek antikanker yang lebih kuat karena meningkatkan generasi ROS dan menghambat proliferasi sel kanker di bawah iradiasi cahaya.
Selain itu, flow cytometry digunakan untuk mendeteksi secara kuantitatif apoptosis sel di bawah berbagai perlakuan oleh pewarnaan ganda annexin V–FITC/propidium iodide. Tidak ada apoptosis yang jelas (apoptosis awal atau apoptosis akhir) yang terdeteksi pada kelompok kontrol, NV-PCN, atau cahaya saja. Sebaliknya, ketika sel diobati dengan Ce6 dan NV-PCN di bawah iradiasi cahaya, sel apoptosis awal dan sel apoptosis akhir meningkat masing-masing menjadi 3,55% dan 3,66% dan menjadi 14,51% dan 33,42%. Hasil analisis Western blot dan imunofluoresensi selanjutnya mengkonfirmasi bahwa protein terkait apoptosis cleaved caspase 3 diaktifkan dan ekspresinya secara signifikan lebih besar pada kelompok NV-PCN+ cahaya daripada pada kelompok lainnya, menunjukkan bahwa kotreatment NV-PCN + cahaya menginduksi efek PDT yang kuat dan secara efektif memicu apoptosis sel tumor. Singkatnya, hasil ini menunjukkan bahwa NV-PCN yang disiapkan di bawah iradiasi LED meningkatkan aktivitas antikanker dengan menginduksi kerusakan DNA yang diperantarai •OH dan disfungsi mitokondria, menurunkan regulasi ATP, memperkuat badai ROS, menghambat DNA-damage repair, dan meningkatkan regulasi protein terkait apoptosis.
NV-PCN: Tidak Hanya Ampuh, Tapi Juga Aman
Performa NV-PCN yang sangat baik pada tingkat sel mendorong evaluasi kemanjuran PDT NV-PCN pada kanker padat pada tikus nude BALB/c yang membawa tumor Cal-27. Sebelum melakukan studi antitumor, biodistribusi Cy5.5–NV-PCN setelah injeksi intratumoral dideteksi dengan melacak fluoresensi Cy5.5 menggunakan sistem pencitraan in vivo. Distribusi fluoresensi Cy5.5–NV-PCN jangka panjang selama 72 jam menunjukkan kapasitas akumulasi tumor NV-PCN yang sangat baik. Selain jaringan tumor, ginjal, salah satu organ metabolisme utama, juga menunjukkan banyak agregasi fluoresensi dibandingkan dengan kelompok kontrol dalam waktu 6 jam, menunjukkan bahwa beberapa NV-PCN dapat diekskresikan terutama melalui ginjal tanpa dampak yang jelas pada organ yang tersisa.
Kemudian, efek antikanker in vivo dari PDT yang diperantarai NV-PCN diselidiki. Selama eksperimen, berat tikus di semua kelompok berubah sedikit dalam waktu 22 hari, menunjukkan bahwa NV-PCN tidak memiliki efek samping sistemik yang jelas in vivo. Dibandingkan dengan kelompok kontrol dan kelompok perlakuan tunggal (NV-PCN, cahaya), Ce6 + cahaya dan NV-PCN + cahaya secara efektif menekan pertumbuhan tumor, dengan kelompok NV-PCN + cahaya menunjukkan efek yang lebih nyata. Efek photosensitizing yang memuaskan dikaitkan dengan peningkatan generasi ROS, yang mengarah pada kematian sel kanker dalam jalur apoptosis. Setelah 22 hari, semua tikus dieutanasia untuk memanen jaringan tumor dan menimbangnya untuk secara langsung mengeksplorasi kemanjuran berbagai perlakuan. Tikus yang menerima perlakuan Ce6 + cahaya dan NV-PCN + cahaya memiliki volume tumor yang jauh lebih kecil, yang cocok dengan baik dengan kurva pertumbuhan tumor.
Efek terapeutik juga dikonfirmasi oleh hasil patologis. Semua kelompok menunjukkan berbagai tingkat nekrosis tumor pada pewarnaan H&E. Khususnya, kelompok NV-PCN + cahaya menunjukkan kerusakan jaringan tumor (sekitar 75% dan 80%). Selain itu, sel kanker pada kelompok NV-PCN + cahaya menunjukkan sinyal Ki67 terlemah dan sinyal TUNEL terkuat, menunjukkan bahwa perlakuan ini dapat secara maksimal menghambat proliferasi sel dan meningkatkan apoptosis sel. Perlu dicatat bahwa PDT NV-PCN dikonfirmasi secara efektif meningkatkan ekspresi γH2AX dan cleaved caspase 3, menyiratkan kerusakan dan apoptosis DNA yang serius.
Keamanan nanomedisin adalah perhatian kritis dalam penerapannya dalam biomedisin. Akibatnya, eksperimen termasuk pewarnaan H&E organ utama dan hematologi darah dilakukan untuk memastikan aplikasi aman NV-PCN dan Ce6 in vivo. Organ utama (jantung, hati, limpa, paru-paru, dan ginjal) dikumpulkan setelah berbagai perlakuan untuk pewarnaan H&E, dan morfologi histologis organ utama tampak tidak terpengaruh di semua kelompok. Uji biokimia darah dan hematologi juga menunjukkan efek yang dapat diabaikan dalam parameter yang signifikan. Semua hasil ini menunjukkan bahwa NV-PCN, mirip dengan Ce6, adalah nanoplatform yang aman untuk terapi kanker.
Kesimpulan: Cahaya di Ujung Terowongan Kanker
Singkatnya, nitrogen vacancy (NV)–modified PCN (NV-PCN) dirancang untuk PDT OSCC yang diinduksi sel Cal-27 yang secara efektif menginduksi apoptosis sel Cal-27 dengan memicu kerusakan DNA dan menghambat DNA-damage repair. Pengenalan NV tidak hanya lebih meningkatkan aksesibilitas sel PCN dengan meningkatkan kandungan –NH2, tetapi juga menyediakan situs reaktif untuk reduksi H2O2 dan memfasilitasi pemisahan carrier, yang bermanfaat untuk produksi •OH skala besar. Selain itu, uji EPR dan •OH intraseluler mengungkapkan bahwa NV-PCN menunjukkan efisiensi generasi •OH yang superior di bawah iradiasi cahaya tampak.
Oleh karena itu, NV-PCN mengarah pada ledakan •OH di sekitar nuklei dan mitokondria sel Cal-27 di bawah iluminasi, yang secara efektif membunuh sel Cal-27 melalui sinkronisasi yang mengarah pada kerusakan DNA nukleus dan disfungsi mitokondria. Kemudian, disfungsi mitokondria memicu badai ROS untuk mengintensifkan kerusakan DNA. Ini juga melemahkan rantai energi ATP untuk menghambat DNA-damage repair. Dibandingkan dengan photosensitizer yang bergantung pada O2 Ce6, PDT berbasis NV-PCN memiliki kemanjuran antitumor yang lebih kuat in vitro dan in vivo. Oleh karena itu, jenis nanopartikel ini tidak hanya mewakili photosensitizer yang efisien untuk PDT kanker yang ditingkatkan, tetapi juga membuka jalan baru untuk studi mendalam tentang PDT kanker berbasis carbon nitride. Intinya, NV-PCN ini bukan cuma alat, tapi partner in crime kita buat ngalahin kanker!
